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噬菌体的检查及效价测定

发表时间:2020-02-11 19:23

1、目的:
1.1 了解噬菌体效价的含义及其测定原理。
1.2 学会检查噬菌体的方法。
1.3 掌握用双层琼脂平板法测定噬菌体效价的操作技能。
2、原理:
噬菌体是一类专性寄生于细菌和放线菌等微生物的病毒,其个体形态极其微小,用常规微生物计数法无法测得其数量。当烈性噬菌体侵染细菌后会迅速引起敏感细菌 裂解,释放出大量子代噬菌体,然后它们再扩散和侵染周围细胞,最终使含有敏感菌的悬液由混浊逐渐变清,或在含有敏感细菌的平板上出现肉眼可见的空斑──噬 菌斑。了解噬菌体的特性,快速检查、分离,并进行效价测定,对在生产和科研工作中防止噬菌体的污染具有重要作用。
检样可以是发酵液、空气、污水、土壤等(至于无法采样而需检查的对象,可以用无菌水浸湿的棉花涂拭表面作为检查样品)。为了易于分离可先经增殖培养,使样品中的噬菌体数量增加。
采用生物测定法进行噬菌体检查,约需12h左右,因而不能及时判断是否有噬菌体污染。通过快速检查可大致确定是否有噬菌体污染,以采取必要的防治措施。根 据正常发酵(培养)液离心后菌体沉淀,上清液蛋白含量很少,加热后仍然清亮;而侵染有噬菌体的发酵(培养)液经离心后其上清液中因含有自裂解菌中逸出的活 性蛋白,加热后发生蛋白质变性,因而在光线照射下出现丁达尔效应而不清亮。此法简单、快速,对发酵液污染噬菌体的判断亦较准确。但不适于溶源性细菌及温合 噬菌体的诊断,对侵染噬菌体较少的一级种子培养液也往往不适用。
噬菌体的效价即1mL样品中所含侵染性噬菌体的粒子数。效价的测定一般采用双层琼脂平板法。由于在含有特异宿主细菌的琼脂平板上,一般一个噬菌体产生一个 噬菌斑,故可根据一定体积的噬菌体培养液所出现的噬菌斑数,计算出噬菌体的效价。此法所形成的噬菌斑的形态、大小较一致,且清晰度高,故计数比较准确,因 而被广泛应用。
3、材料:
3.1菌种:
敏感指示菌(大肠杆菌)、大肠杆菌噬菌体(从阴沟或粪池污水中分离)。
3.2培养基:
二倍肉膏蛋白胨培养液,上层肉膏蛋白胨半固体琼脂培养基(含琼脂0.7%,试管分装,每管5mL),下层肉膏蛋白胨固体琼脂培养基(含琼脂2%),1%蛋白胨水培养基。
3.3仪器和器具:
无菌的试管、培养皿、三角瓶、移液管(1、5mL),恒温水浴锅,离心机、721分光光度计等。
4、流程:
4.1噬菌体的检查
4.2噬菌体效价的测定
5、方法:
5.1 噬菌体的检查:
5.1.1 样品采集
将2~3g土样或5mL水样(如阴沟污水)放入灭菌三角瓶中,加入对数生长期的敏感指示菌(大肠杆菌)菌液3~5mL,再加20mL二倍肉汤蛋白胨培养液。
5.1.2 增殖培养
30℃振荡培养12~18h, 使噬菌体增殖。
5.1.3 离心分离
将上述培养液以3000rpm离心15~20min, 取上清液,用pH7.0,1%蛋白胨水稀释至10-2~10-3,用于噬菌体检查及效价测定。
5.1.4 生物测定法
5.1.4.1双层琼脂平板法
5.1.4.1.1 倒下层琼脂
融化下层培养基,倒平板(约10mL/皿)待用。
5.1.4.1.2倒上层琼脂
融化上层培养基,待融化的上层培养基冷却至50℃左右时,每管中加入敏感指示菌 (大肠杆菌) 菌液0.2mL,待检样品液或上述噬菌体增殖液0.2~0.5mL,混合后立即倒入上层平板铺平。
5.1.4.1.3恒温培养
30℃恒温培养6~12h观察结果。
5.1.4.1.4 观察结果
如有噬菌体,则在双层培养基的上层出现透亮无菌圆形空斑──%26not;%26not;%26not;%26not;噬菌斑。
5.1.4.2 单层琼脂平板法
省略下层培养基,将上层培养基的琼脂量增加至2%,融化后冷却至45℃左右,如同上法加入指示菌和检样,混合后迅速倒平板。30℃恒温培养6~16h后观察结果。
5.1.5 离心分离加热法(快速检查)
取大肠杆菌正常培养液和侵染有噬菌体的异常大肠杆菌培养液,4000rpm离心20min,分别取两组发酵液的上清液(A1),一部分于721分光光度计上测定OD650光密度值,另外各取5mL上清液于试管中,置水浴中煮沸2min(A2),检测A2溶液OD650光密度值,记录结果。
5.2 噬菌体效价的测定:
5.2.1 倒平板
将融化后冷却到45℃左右的下层肉膏蛋白胨固体培养基倾倒于11个无菌培养皿中,每皿约倾注10mL培养基,平放,待冷凝后在培养皿底部注明噬菌体稀释度。
5.2.2 稀释噬菌体
按10倍稀释法,吸取0.5mL大肠杆菌噬菌体,注入一支装有4.5mL1%蛋白胨水的试管中,即稀释到10-1,依次稀释到10-6稀释度。
5.3 噬菌体与菌液混合:
将11支灭菌空试管分别标记10-4、10-5、10-6和对照。分别从10-4、10-5和10-6噬菌体稀释液中吸取0.1mL于上述编号的无菌试管 中,每个稀释度平行做三个管,在另外两支对照管中加0.1mL无菌水,并分别于各管中加入0.2mL大肠杆菌菌悬液,振荡试管使菌液与噬菌体液混合均匀, 置37℃水浴中保温5min,让噬菌体粒子充分吸附并侵入菌体细胞。
5.4 接种上层平板:
将11支融化并保温于45℃的上层肉膏蛋白胨半固体琼脂培养基5mL分别加入到含有噬菌体和敏感菌液的混合管中,迅速搓匀,立即倒入相应编号的底层培养基平板表面,边倒入边摇动平板使其迅速地铺展表面。水平静置,凝固后置37℃培养。
5.5 观察并计数:
观察平板中的噬菌斑,并将结果记录于 计算公式:N=Y/V%26#8226;X
(N:效价值,Y:平均噬菌斑数/皿,V:取样量,X:稀释度)
例如:当稀释度为10-6时,取样量为0.1 mL/皿,同一稀释度中3个平板上的噬菌斑的平均值为186个,则该样品的效价为:N=186/0.1%26#215;10-6=1.86%26#215;109。
6、结果:
6.1、噬菌体检查
6.1.1离心分离加热法
处理方法OD650光密度值
正常发酵液(对照) 异常发酵液(试验)
离心上清液(A1)
离心上清液加热煮沸后(A2)
A2/A1
6.1.2 绘出平板上的噬菌斑检测结果,指出噬菌斑和宿主细菌。
6.2、噬菌体效价测定
6.2.1 平板上噬菌斑数目
噬菌体稀释度10-4、10-5、10-6 对照
噬菌斑数(个)/皿
平均每皿噬菌斑数目
6.2.2 计算噬菌体效价(即噬菌斑形成单位pfu, plague-forming unit).

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